Structure of the NuA4 acetyltransferase complex bound to the nucleosome
Qu K#, Chen K#, Wang H#, Li X*, Chen Z*. Structure of the NuA4 acetyltransferase complex bound to the nucleosome. Nature, 2022.
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05303-x
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生物体遗传信息DNA缠绕组蛋白八聚体1.7圈形成了染色体的基本组成单位——核小体。组蛋白H4的 N端尾巴与临近的核小体相互作用，促进染色体高级结构的形成以及异染色质沉默。核小体组装和异染色质形成阻碍了DNA的复制、转录以及损伤修复等重要生物学过程。生物体进化出了一系列的机制来克服核小体的阻碍。其中，组蛋白乙酰化修饰中和赖氨酸侧链的正电荷，并招募其他染色质因子，进而调控染色质折叠、基因转录以及DNA损伤修复等过程。2022年10月5日，清华大学生命科学学院/结构生物学高精尖创新中心/清华-北大生命科学联合中心陈柱成教授与李雪明副教授合作在Nature杂志在线发表题为 Structure of the NuA4 acetyltransferase complex bound to the nucleosome（酿酒酵母NuA4乙酰转移酶复合物结合核小体的结构）的研究论文，揭示了乙酰转移酶NuA4结合核小体以及组蛋白H4空间识别的机理，阐明了NuA4作为转录共激活因子发挥功能的结构基础。
NuA4和SAGA是酿酒酵母两个重要的乙酰转移酶复合物，分别选择性地乙酰化组蛋白H4和H3，调控基因转录。NuA4和SAGA在不同物种中高度保守，前者是酵母生存唯一必须的乙酰转移酶。作为转录共激活因子，二者通过共同亚基Tra1，结合转录因子，被招募至启动子区（图1a）。因为有基础性作用，NuA4自发现至今20多年被不断研究，但其结构研究历史相当曲折，目前尚不清楚精细的分子组装模式以及识别核小体的机理。
图1 NuA4的工作模式图及结合核小体的结构
（a）NuA4与SAGA协同作用促进基因转录的工作模式图；（b）NuA4结合核小体的示意图；（c）NuA4-NCP复合物的电镜密度图。陈柱成课题组早期报道了NuA4活性中心Piccolo亚复合物的晶体结构及其结合核小体的低分辨率冷冻电镜结构。在此基础上，研究团队继续向着NuA4全酶的结构解析进击。然而，研究人员发现NuA4复合物的结构可塑性非常大，活性中心结合核小体的部分无法得到稳定构象。这造成高质量结构解析的关键技术难点。为了限制复合物结构的柔性，研究团队在样品中加入了转录因子Gal4-VP16，并在核小体接头 DNA引入相应的识别DNA序列，作为上游激活信号（UAS）。而且，研究团队对组蛋白H4K16位点进行CMC（carboxymethyl coenzyme A）化学修饰以及H3K36位点进行三甲基化修饰。CMC结合NuA4的催化中心Esa1，稳定Esa1与核小体的作用；H3K36则结合Eaf3亚基。在突破各种技术难题后，最终解析了NuA4结合核小体的冷冻电镜结构（8.8 Å），局部分辨率为2.7-3.4 Å。由13个亚基组成的NuA4复合物分为两个大的模块 （图1c）：乙酰化模块（histone acetyltransferase, HAT）以及转录因子结合模块（transcription activator-binding, TRA）。HAT模块即为Piccolo亚复合物，由Esa1、Epl1的N端区域、Eaf6以及Yng2组成；TRA模块则由Tra1、Eaf1、Eaf2、Act1、Arp4以及Epl1的C端区域组成。Epl1的一段无序区把HAT模块与TRA模块连接在一起。另外，还存在一个“桥型”的结构柔性区。研究人员根据交联质谱推断这部分区域为Eaf3/5/7亚基。从这里可以看出NuA4复合物构造的高度可塑性。该结构显示，携带UAS的linker DNA延伸向Tra1亚基的特定表面（图2a）。研究人员发现该表面在不同物种中高度保守，且众多转录因子与Tra1的结合位点均位于该表面内。因此，该保守面被命名为转录因子结合面（transcription factor binding surface, ABS）。这个发现提供了NuA4被转录因子招募至启动子区域的结构基础。在ABS外周，研究人员发现一个多碱性氨基酸界面（poly-basic surface, PBS）与核小体的linker DNA相互作用（图2b）。研究人员通过生化以及遗传学实验验证了PBS的对乙酰转移活性，以及调控酵母碳源代谢的重要性。（a）转录因子结合表面（ABS）；（b）多碱性氨基酸结合表面（PBS）的结构及其重要性。催化中心HAT模块通过两个关键元件识别核小体的特定位点，结合在核小体盘状结构表面。其中Epl1的“arginine anchor”识别核小体的酸性区， 一段“double function loop (DFL) ”识别核小体的超螺旋1.5（SHL 1.5）位置处DNA的小沟（图3a, c, d）。该核小体识别模式使得Esa1的活性口袋恰好处在H4 的N端尾巴上方。这个结构在全酶水平支持了H4尾巴空间位置识别机制 (图3b)。该机制区别于常见的基于氨基酸序列识别的组蛋白修饰酶工作机制。图3 NuA4 HAT模块识别核小体的机理
（a）HAT模块结合核小体的结构模型；（b）NuA4通过空间位置识别H4的模式图；（c）Arginine anchor局部电镜密度图及其与酸性区相互作用结构细节；（d）多肽竞争性实验显示Arginine anchor对NuA4乙酰化活性的重要性。综上所述，该研究揭示了NuA4通过多个结构元件，协调识别核小体的机理（图1b）。ABS与PBS分别通过转录因子和直接电荷作用结合接头DNA，招募核小体至TRA模块的边缘；在此构象下，HAT模块通过DFL和arginine anchor识别核小体的表面位点，从而发挥选择性乙酰化H4的功能。TRA模块与HAT模块之间的可塑性，使得NuA4能够适应复杂多样的染色体环境中被不同转录因子招募。除了Eaf5亚基之外，其他亚基在人源TIP60复合物中均存在同源蛋白。因此，该研究对于理解TIP60复合物的组装及工作机制提供了很好的模型。值得一提的是，该工作TRA模块的结构被另外三个单独的NuA4复合物的结构研究所验证（预印版，见延伸阅读）。
清华大学生命科学学院陈柱成教授、李雪明副教授为本文共同通讯作者，清华大学生命科学学院瞿珂珂、陈康净、王皓为该论文共同第一作者。
酿酒酵母NuA4乙酰转移酶复合体（人源TIP60的同源复合体）在基因转录、DNA修复和细胞周期进展中发挥重要作用，在真核生物中高度保守；负责细胞内组蛋白，以及250多种非组蛋白底物的乙酰化修饰。酿酒酵母的NuA4由13个亚基组成，仅有一个亚基专属于NuA4，另外12个亚基还参与其他表观遗传调控的复合体的组装；导致NuA4/TIP60复合体的组装高度动态，之前的结构信息也仅限于NuA4/TIP60的亚复合物。
近日，清华大学陈柱成与李雪明课题组合作在Nature杂志上发表NuA4与核小体复合物的结构。早在2016年，陈柱成课题组和朱平课题组合作解析了NuA4催化模块Piccolo结合核小体的低分辨率冷冻电镜结构。多年来，研究团队执着公关，通过改造核小体底物、添加转录因子，成功稳定了NuA4全酶与核小体的动态相互作用。在突破各种技术难题后，成功解析了NuA4全酶结合核小体的冷冻电镜结构，局部分辨率达到了2.7-3.4 Å，首次清晰揭示了NuA4结合核小体及其识别组蛋白H4的机理。这项工作是NuA4复合体研究的里程碑式的成果，为进一步理解NuA4发挥转录共激活因子的功能的提供了结构基础。这一研究结果是NuA4/TIP60领域的又一个重大突破，填补了NuA4全酶组装及其催化核小体修饰认识的一大空白，具有非常重要的意义。
目前的NuA4/TIP60的结构信息仅限于酿酒酵母，考虑到单细胞的酿酒酵母与其他物种，尤其是高等的哺乳动物的巨大差异，其他物种的NuA4/TIP60复合体的结构有望提供更多不同层次的信息。这项工作巧妙的实验设计，也为解析人源TIP60全酶复合体的结构和催化机制也提供了重要的借鉴。
精准控制染色体结构是真核生物转录调控关键环节。组蛋白乙酰转移酶的发现是现代表观遗传学发展最重要的里程碑之一。1996年David Allis与合作者首次证明了组蛋白乙酰转移酶（HAT）GCN5的体外活性【1】，然而其酶活非常微弱，活性检测需要长达1个多月的曝光。但随着数个多亚基组蛋白乙酰复合物的鉴定【2】，人们开始认识到调节亚基对于这些修饰酶的染色体定位及催化活性的重要性，表观遗传学研究的逻辑脉络也随之逐渐清晰。酵母NuA4（Nucleosome Acetyltransferase of Histone H4 complex）是最早被鉴定的乙酰化复合物之一，在进化上高度保守，参与调控基因转录、DNA 损伤修复、异染色质沉默、细胞周期进展和染色体稳定性等多种过程，并在癌症、神经退行性疾病及衰老相关疾病中起重要作用。NuA4对于核小体具有很强的特异活性，然而其与核小体的结合能力极弱【3】，暗示NuA4介导的乙酰化的高度动态性。加之多亚基超大复合物内在的结构所具有的柔性，使得解析这类表观遗传修饰复合物与底物结合的高分辨结构极具挑战性。
近期陈柱成课题组巧妙地利用NuA4与核小体底物多种互作的生化特性，解决了领域中这一重要的瓶颈问题。他们采用序列特异的转录因子将NuA4锚定在核小体底物上，并在核小体上点缀上组蛋白H3 K36位三甲基化（可以被其Eaf3亚基的甲基化阅读器识别）以及H4K16上的双底物模拟物（bi-substrate analog）修饰 (可以稳定地与催化亚基Esa1的活性中心结合)， 从而成功地捕获了NuA4发挥功能瞬间的构象。他们发表在Nature上的最新研究成果首次揭示了超大表观修饰复合物与核小体结合的高分辨冷冻电镜结构。该结构不仅展示了NuA4中催化模块和转录因子结合模块（Tra）相互网络连接，更重要的是确定了复合物在核小体上的相对结合走向以及如何将催化模块准确地定位于H4底物。结构显示NuA4主要通过以下关键界面与底物核小体发生特异互作：（1）转录因子结合Tra模块。由于转录因子锚定产生了结合方向性，得以鉴定Tra1模块与多种转录因子结合的界面，并发现其序列保守性远高于处于相反方向的类似区域；（2）Tra模块的富碱性界面则与核小体的接头 DNA互作；（3）催化模块的双功能环与核小体DNA互作，并利用两个“精氨酸锚”与核小体侧面的酸性区域互作，从而将催化中心定位于特异底物。重要的是这些相互作用多为单点的动态互作，因此既保证了与底物的结合，又可以实现复合物高效的周转。综上所述，这项工作展示了转录因子介导的表观复合物在染色体上的定位以及调控亚基如何协作以保障催化反应的特异性，是组蛋白乙酰转移酶研究的重要突破。
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05303-x https://www.researchsquare.com/article/rs-1497616/v1https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.07.11.499577v1https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.06.24.497536v1
